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写在前面——关于聚乙二醇修饰1

第1章 单甲氧基聚乙二醇的合成6

1.1 聚乙二醇的结构及性质7

1.1.1 聚乙二醇链的空间结构7

1.1.2 聚乙二醇的物理性质8

1.1.3 聚乙二醇的生物学性质10

1.1.4 聚乙二醇的化学性质11

1.2 聚乙二醇的合成11

1.2.1 链引发12

1.2.2 链增长16

1.2.3 链终止／链转移17

1.2.4 单甲氧基聚乙二醇的聚合17

1.3 环氧乙烷阴离子聚合制备聚乙二醇的实验技术19

1.3.1 单体的储存、纯化与转移操作技术19

1.3.2 溶剂的储存、预处理及使用20

1.3.3 引发剂的制备及分析21

1.3.4 聚合设备21

1.4 具有空间结构的聚乙二醇的合成23

1.4.1 分枝型聚乙二醇23

1.4.2 分叉型聚乙二醇25

1.4.3 异端基双官能团聚乙二醇26

1.4.4 树状聚乙二醇28

1.4.5 多价聚乙二醇30

1.5 聚乙二醇及其衍生物的表征31

1.5.1 核磁共振31

1.5.2 红外光谱32

1.5.3 液相色谱／凝胶渗透色谱34

1.5.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱36

1.5.5 显色反应37

1.5.6 电泳38

1.6 结论与展望38

参考文献39

第2章 单甲氧基聚乙二醇的活化44

2.1 聚乙二醇羟基的转化45

2.1.1 卤化、磺酸酯化和光延反应45

2.1.2 羟基的氧化49

2.1.3 以醚键偶联的功能性衍生物55

2.1.4 以酯、碳酸酯、氨基甲酸酯偶联的功能性衍生物56

2.1.5 其他衍生策略58

2.2 用于生物大分子修饰的聚乙二醇衍生物合成58

2.2.1 氨基修饰剂的合成58

2.2.2 羧基修饰剂的合成69

2.2.3 巯基修饰剂的合成70

2.2.4 用于精氨酸修饰的聚乙二醇修饰剂74

2.2.5 用于二硫键修饰的聚乙二醇修饰剂75

2.2.6 可逆聚乙二醇修饰剂76

2.2.7 羰基修饰剂的合成77

2.3 工业化规模的单甲氧基聚乙二醇衍生物合成78

2.3.1 反应系统的设计和搭建78

2.3.2 产品的开发80

2.4 结论与展望80

参考文献81

第3章 聚乙二醇修饰蛋白质的反应控制84

3.1 氨基酸侧链基团的反应控制84

3.1.1 赖氨酸85

3.1.2 半胱氨酸86

3.1.3 天冬氨酸和谷氨酸87

3.1.4 精氨酸88

3.1.5 组氨酸89

3.1.6 糖蛋白的糖基90

3.2 聚乙二醇修饰反应的优化91

3.2.1 聚乙二醇修饰剂的选择91

3.2.2 蛋白质的聚乙二醇修饰条件92

3.2.3 聚乙二醇的分子量95

3.2.4 通过反应工程控制聚乙二醇修饰96

3.3 氨基酸侧链的聚乙二醇定点修饰98

3.3.1 酶学催化的聚乙二醇定点修饰99

3.3.2 二硫键的聚乙二醇定点修饰100

3.3.3 马来酸酐可逆保护蛋白质的氨基102

3.3.4 高碘酸钠氧化N-末端具有丝氨酸或苏氨酸的蛋白质104

3.3.5 蛋白质的N-末端定点修饰104

3.4 化学反应基团的引入与聚乙二醇修饰106

3.4.1 基因工程方法引入半胱氨酸106

3.4.2 化学合成方法引入半胱氨酸107

3.4.3 对天然包埋半胱氨酸的利用108

3.4.4 还原抗体的二硫键109

3.4.5 化学方法引入巯基110

3.4.6 基因工程方法引入非天然氨基酸111

3.4.7 基因工程方法引入醛基112

3.4.8 基因工程方法缺失赖氨酸113

3.5 保护蛋白质活性中心的聚乙二醇修饰方法114

3.5.1 保护亲和素亲和位点的修饰方法114

3.5.2 保护酶底物结合位点的修饰方法115

3.5.3 保护血红蛋白Cys-93（β）的修饰方法116

3.5.4 控制修饰剂比例和分离纯化制备高活性修饰产物117

3.6 固相吸附辅助的PEG修饰117

3.6.1 离子交换介质辅助的PEG修饰反应118

3.6.2 亲和层析介质辅助的PEG修饰反应119

3.6.3 分子排阻反应层析121

3.6.4 共价层析介质辅助的PEG修饰122

3.6.5 微孔疏水相互作用膜辅助的PEG修饰123

参考文献124

第4章 聚乙二醇-蛋白质偶联物的分离纯化130

4.1 PEG-蛋白质偶联物的理化特性132

4.2 PEG-蛋白质偶联物的分离纯化方法134

4.2.1 基于分子量、分子大小的分离纯化方法136

4.2.2 基于电荷的分离纯化方法149

4.2.3 基于疏水性的分离153

4.2.4 基于亲和作用的分离方法158

4.2.5 基于溶解度的分离159

4.2.6 最新研究进展160

4.3 结论与展望173

参考文献174

第5章 聚乙二醇-生物大分子偶联物的分析与质量鉴定180

5.1 分子量和大小（水力学半径）的检测181

5.1.1 电泳法181

5.1.2 高效液相-尺寸排阻色谱法183

5.1.3 质谱法185

5.2 浓度的测定187

5.2.1 微量凯氏定氮法188

5.2.2 双缩脲法188

5.2.3 Folin-酚试剂法189

5.2.4 考马斯亮蓝法189

5.2.5 BCA法190

5.2.6 紫外吸收法190

5.3 蛋白质二级结构的检测191

5.3.1 荧光光谱法191

5.3.2 圆二色谱法192

5.3.3 核磁共振法193

5.4 荷电性质的测定197

5.5 免疫性质的测定198

5.5.1 蛋白质印迹法198

5.5.2 表面等离子体共振法199

5.6 位点异构体及修饰位点的检测202

5.6.1 PEG-IFN位点异构体及修饰位点的检测202

5.6.2 PEG-G CSF修饰位点的检测208

5.7 游离PEG残留量的检测209

5.7.1 分光光度法209

5.7.2 液相色谱-蒸发光散射检测210

5.7.3 SDS-PAGE法213

5.8 修饰度的检测215

5.9 纯度分析216

5.9.1 高效液相-尺寸排阻色谱法216

5.9.2 反相高效液相色谱法217

5.9.3 毛细管电泳结合MALDI-TOF MS法218

5.10 结论与展望219

参考文献220

第6章 聚乙二醇化药物的药代动力学224

6.1 PEG化药物药代动力学研究分析方法230

6.1.1 放射性同位素标记法231

6.1.2 生物活性分析法234

6.1.3 酶联免疫标记法235

6.1.4 电化学发光免疫分析法237

6.1.5 比色法238

6.1.6 高效液相色谱法238

6.1.7 液相色谱-串联质谱法239

6.1.8 电泳方法245

6.1.9 PEG化药物分析方法的瓶颈与展望245

6.2 PEG化药物的药代动力学246

6.2.1 直接PEG化药物的药代动力学246

6.2.2 PEG化脂质体258

6.2.3 PEG化的聚合物胶束267

6.2.4 纳米颗粒的PEG化273

6.3 结论与展望277

参考文献278

第7章 PEG修饰长效药物293

7.1 PEG修饰药物上市及在研情况293

7.1.1 修饰药物的种类293

7.1.2 修饰产物结构与性质294

7.2 上市PEG修饰长效药物简介299

7.2.1 PEG-腺苷脱氨酶（AdagenR）299

7.2.2 PEG-天冬酰胺酶（OncasparR）301

7.2.3 PEG-干扰素α-2a（PegasysR）302

7.2.4 PEG-干扰素α-2b（PegintronR）305

7.2.5 PEG-集落刺激因子（NeulastaR）306

7.2.6 PEG-生长激素受体拮抗剂（SomavertR）306

7.2.7 PEG-抗血管内皮生长因子适配体（MacugenR）308

7.2.8 PEG-促红细胞生成素β（MirceraR）310

7.2.9 PEG-抗肿瘤坏死因子α抗体Fab′片段（CimziaR）312

7.2.10 PEG-重组人尿酸氧化酶（KrystexxaR）313

7.2.11 PEG-inesatide合成肽（OmontysR）314

7.3 临床期PEG修饰长效药物简介316

7.3.1 PEG-小分子难溶药物316

7.3.2 PEG-酶319

7.3.3 PEG-细胞因子323

7.3.4 PEG-多肽325

7.3.5 其他PEG修饰的长效制剂326

7.4 PEG修饰药物研究中存在的局限性及解决方向329

7.4.1 PEG修饰位点及修饰度的确定329

7.4.2 PEG的高分子结构330

7.4.3 PEG分子量的大小对药物代谢方式的影响330

7.4.4 PEG长效制剂的载药量及释放效率330

7.5 结论与展望331

参考文献331

附录 常见PEG修饰剂的合成操作337